ELISA雙抗體夾心法操作步驟

　　（1）包被：用包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1-10 μg/mL。在酶標(biāo)板反應(yīng)孔中加0.1 mL，4℃過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗板3 次，每次3 min。

　　（2）加樣：加一定濃度稀釋的待檢樣品（同時(shí)做空白對照，陰性對照孔及陽性對照）0.1 mL 于上述已包被的反應(yīng)孔中，置濕盒中，37℃， 1 hr。用洗滌緩沖液洗板3 次，每次3 min。

　?。?）加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體 （經(jīng)滴定后的稀釋度） 0.1ml。

　　37℃，0.5 - 1 hr，用洗滌緩沖液洗板3 次，每次3 min。

　?。?）加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入現(xiàn)配的TMB 底物溶液0.1 mL，37 ℃，10 - 30min。

　?。?）終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入終止液0.05 mL。

　　（6）結(jié)果判定：將酶標(biāo)板在酶標(biāo)儀上，于450 nm （若ABTS 顯色，讀410 nm），讀數(shù)，輸出到Excel 中。

　?。?）以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，生成標(biāo)準(zhǔn)曲線和直線回歸方程式，根據(jù)公式計(jì)算未知樣品的濃度，并記錄。

　　雙抗夾心法分雙抗體夾心測抗原和雙抗原夾心測抗體，方法都是類似的。就以雙抗體夾心測抗原為例吧 大概步驟如下 ：1、將異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗體。洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。2、加待檢標(biāo)本，保溫反應(yīng)，洗滌除去未結(jié)合物質(zhì)。3、加酶標(biāo)抗體，保溫反應(yīng)，洗滌除去未結(jié)合物質(zhì)。4、加底物顯色。