實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)常用的elisa試劑盒在科研中常用于測(cè)量生物樣本中抗原、抗體、肽、蛋白質(zhì)、激素或其他生物分子的存在和/或濃度。它非常靈敏，能夠檢測(cè)出低濃度的抗原。ELISA的靈敏度歸因于它能夠檢測(cè)單個(gè)抗原-抗體復(fù)合物之間的相互作用。除此之外，加入酶偶聯(lián)抗原特異性抗體可以將無(wú)色底物轉(zhuǎn)化為顯色或熒光產(chǎn)物，這些產(chǎn)物可以通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)和輕松定量。當(dāng)與已知抗原滴定量產(chǎn)生的值進(jìn)行比較時(shí)，可以確定實(shí)驗(yàn)樣本中相同抗原的濃度。

  雖然不同的科研人員可能使用不同的ELISA試劑盒方案來(lái)測(cè)量樣本中的抗原濃度，但這些方案都基于相同的原理。選擇要執(zhí)行的ELISA類型（間接、夾心或競(jìng)爭(zhēng)）取決于許多因素，包括要測(cè)試的樣本的復(fù)雜性和可用的抗原特異性抗體。間接ELISA常用于確定免疫反應(yīng)的結(jié)果，例如測(cè)量樣本中抗體的濃度。夾心ELISA最適合分析復(fù)雜樣本，例如組織培養(yǎng)上清液或組織裂解物，其中分析物或目標(biāo)抗原是混合樣本的一部分。最后，當(dāng)只有一種抗體可用于檢測(cè)目標(biāo)抗原時(shí)，最常使用競(jìng)爭(zhēng)性ELISA。競(jìng)爭(zhēng)性ELISA還可用于檢測(cè)只有一個(gè)抗體表位的小抗原，由于空間位阻，這種抗原無(wú)法容納兩種不同的抗體。接下來(lái)上海紀(jì)寧生物為大家詳細(xì)描述一下ELISA試劑盒檢測(cè)方法及實(shí)驗(yàn)步驟。

  間接ELISA法及實(shí)驗(yàn)步驟

  間接ELISA檢測(cè)通常用于測(cè)量血清或雜交瘤培養(yǎng)上清液中的抗體量。間接ELISA檢測(cè)的一般步驟如下：

  用抗原包被孔

  加入含有抗體（一抗或1°抗體）的血清或雜交瘤培養(yǎng)上清液

  孵育并清洗

  添加二抗（或2°）酶聯(lián)抗體

  孵育并清洗

  添加底物

  夾心ELISA法及實(shí)驗(yàn)步驟

  夾心ELISA檢測(cè)不同于間接ELISA檢測(cè)，因?yàn)樵摲椒ú簧婕坝眉兓目乖话?。相反，使?/span>“捕獲”抗體包被板的孔。抗原“夾”在捕獲抗體和第二個(gè)“檢測(cè)”酶偶聯(lián)抗體之間——其中兩種抗體對(duì)同一抗原具有特異性，但針對(duì)不同的表位。通過(guò)與捕獲抗體/抗原復(fù)合物結(jié)合，檢測(cè)抗體保留在板中。單克隆抗體或多克隆抗血清可用作捕獲和檢測(cè)抗體。夾心ELISA的主要優(yōu)點(diǎn)是分析前無(wú)需純化樣品。此外，該檢測(cè)非常靈敏。許多市售ELISA試劑盒都是夾心類型，使用經(jīng)過(guò)測(cè)試的匹配抗體對(duì)。夾心ELISA檢測(cè)的一般程序是：

  用捕獲抗體包被孔

  添加含有抗原的測(cè)試樣本

  孵育并清洗

  添加酶聯(lián)檢測(cè)抗體。

  孵育并清洗

  添加底物

  大多數(shù)市售的夾心ELISA試劑盒都配有酶偶聯(lián)檢測(cè)抗體。如果沒(méi)有酶偶聯(lián)檢測(cè)抗體，可以使用針對(duì)檢測(cè)抗體的特異性二抗。二抗上的酶起著相同的作用，即將無(wú)色底物轉(zhuǎn)化為顯色或熒光產(chǎn)物。例如，上述二抗更傾向于在由已經(jīng)生成自己的單克隆抗體的研究人員開(kāi)發(fā)的“自制”夾心ELISA中使用。使用二抗的一個(gè)缺點(diǎn)是要確保它只與檢測(cè)抗體結(jié)合，而不是與結(jié)合到板上的捕獲抗體結(jié)合。這將導(dǎo)致所有孔中都有可測(cè)量的產(chǎn)物，無(wú)論是否存在抗原或檢測(cè)抗體。

  競(jìng)爭(zhēng)ELISA法及實(shí)驗(yàn)步驟

  最后，使用競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢測(cè)可溶性抗原。該方法操作簡(jiǎn)單，但僅適用于純化抗原量較大時(shí)。競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢測(cè)的一般程序?yàn)椋?/span>

  用抗原包被孔

  孵育并清洗

  將測(cè)試樣品與酶偶聯(lián)的一抗預(yù)孵育

  將混合物加入

  孵育并洗去任何未結(jié)合的酶偶聯(lián)一抗

  添加底物

  本測(cè)定中的“競(jìng)爭(zhēng)”源自于這樣的事實(shí)：步驟3中使用的測(cè)試樣品中的抗原越多，可與孔中包被的抗原結(jié)合的抗體就越少。因此，測(cè)定結(jié)束時(shí)孔中顯色/熒光產(chǎn)物的強(qiáng)度與測(cè)試樣品中存在的抗原量成反比。

  任何類型的ELISA中的關(guān)鍵組成部分都是已知濃度的滴定標(biāo)準(zhǔn)，它使用戶能夠確定測(cè)試樣本中存在的抗原濃度。通常，會(huì)指定一系列孔來(lái)創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中將已知量的純化重組蛋白以遞減的量添加到孔中。當(dāng)這些孔與測(cè)試樣本同時(shí)處理時(shí)，用戶可以從微孔板讀數(shù)器獲得一組已知蛋白質(zhì)濃度的參考吸光度值，以配合測(cè)試樣本的吸光度值。然后，用戶可以計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線，將測(cè)試樣本與該標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，以確定存在的目標(biāo)蛋白質(zhì)量。標(biāo)準(zhǔn)曲線還可以確定用戶稀釋的精確度。

  最后，上述每種ELISA類型的最后一步都需要添加底物。底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的程度與孔中存在的酶量直接相關(guān)。辣根過(guò)氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(AP)是與抗體結(jié)合的最常見(jiàn)酶。正如預(yù)期的那樣，有許多底物可用于產(chǎn)生顯色或熒光產(chǎn)物的酶。此外，底物的靈敏度范圍很廣，可以提高檢測(cè)的整體靈敏度。在選擇要使用的底物類型及其相應(yīng)的酶結(jié)合抗體時(shí)，用戶還必須考慮實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)可用于讀取板的儀器類型。

  HRP常用的顯色底物包括2,2'-聯(lián)氮雙[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]-二銨鹽(ABTS)和3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，而AP則使用對(duì)硝基苯基磷酸酯(PNPP)。ABTS和TMB分別產(chǎn)生水溶性綠色和藍(lán)色反應(yīng)產(chǎn)物。綠色ABTS產(chǎn)物有兩個(gè)主要吸光度峰，分別為410和650nm，而藍(lán)色TMB產(chǎn)物在370和652nm處檢測(cè)效果最佳。加入酸性終止液后，ABTS和TMB的顏色會(huì)變成黃色，最佳讀數(shù)為450nm。ABTS顯色速度慢，而TMB顯色速度快。TMB比ABTS更靈敏，如果酶促反應(yīng)進(jìn)行時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可能會(huì)產(chǎn)生更高的背景信號(hào)。PNPP經(jīng)AP轉(zhuǎn)化后生成黃色水溶性產(chǎn)物，在405nm處吸收光。