53-84-9 / 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的制備

背景及概述^[1-2]

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸又稱輔酶Ⅰ。脫氫酶輔酶的一種。為煙酰胺核苷酸與腺嘌呤核苷酸的縮合物，存在氧化型和還原型兩種形式，分別簡(jiǎn)寫成NAD⁺和NADH+H⁺。含有維生素B₅，其煙酰胺吡啶環(huán)在反應(yīng)中可以可逆地進(jìn)行脫氫和得氫(或得失電子)作用。為一些不需氧脫氫酶的輔酶，在生物體內(nèi)起傳遞氫的作用。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸主要存在于酵母細(xì)胞線粒體中，目前通常選用破壁和提純的方法制備煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，常用的破壁方法有溫差法(熱處理法)和高壓均漿法，溫差法破壁效果不理想，高壓均漿法不適合工業(yè)化大生產(chǎn)，常用的提純方法為柱洗脫，但是柱洗脫過(guò)程繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，不利于工業(yè)化生產(chǎn)，溶劑使用量大，污染環(huán)境，制得的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸純度低，收率低。因此需要提供一種新的制備方法。

功能^[3-5]

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸參與細(xì)胞物質(zhì)代謝、能量合成、細(xì)胞DNA修復(fù)等多種生理活動(dòng)，對(duì)機(jī)體免疫能力有重要作用。在健康狀態(tài)下，人體內(nèi)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸濃度穩(wěn)定，維持各項(xiàng)細(xì)胞正常功能。體內(nèi)的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸濃度決定了細(xì)胞衰老的過(guò)程和程度，濃度下降會(huì)加速細(xì)胞衰老的過(guò)程。

研究表明，NAD+對(duì)缺血手術(shù)引起的腎臟梗死具有保護(hù)作用，可以顯著減少血清中尿素氮、肌酐水平；NAD+對(duì)缺血手術(shù)引起的腎小管損傷具有保護(hù)作用。NAD+(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，Nicotinamideadeninedinucleotide，簡(jiǎn)稱NAD+)可以有效保護(hù)腎臟缺血引起的腎臟損傷，NAD+在制備防治腎臟缺血性損傷藥物中有重要應(yīng)用價(jià)值。

另外，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸在制備治療炎性痛藥物中具有一定的應(yīng)用，NAD+通過(guò)依賴NAD+的去乙酰化酶SIRT1和SIRT2參與調(diào)節(jié)福爾馬林和完全弗氏佐劑(CFA)誘發(fā)的炎癥痛，而SIRT1和SIRT2通過(guò)不同機(jī)制參與NAD+對(duì)炎癥痛的抑制作用，從而達(dá)到對(duì)炎性痛具有鎮(zhèn)痛的作用。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸在制備防治化療藥物鹽酸阿霉素誘導(dǎo)的肝臟損傷藥物中也具有的應(yīng)用，NAD+不但可以有效防治化療藥物鹽酸阿霉素造成的肝臟損傷，而且我們還發(fā)現(xiàn)NAD+可以有效殺死神經(jīng)膠質(zhì)腫瘤細(xì)胞、神經(jīng)元腫瘤細(xì)胞、胃癌腫瘤細(xì)胞、腎癌腫瘤細(xì)胞或乳腺癌腫瘤細(xì)胞，對(duì)于正常原代細(xì)胞沒(méi)有殺傷作用。

制備^[1]

一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的制備方法，包括如下步驟：

S1、破碎細(xì)胞：將酵母細(xì)胞加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.04wt％鹽酸水溶液中浸泡2.5h，進(jìn)行溫差破壁處理后，用孔徑為40nm的陶瓷膜過(guò)濾，取濾液得到清液A，其中，酵母細(xì)胞和鹽酸水溶液的重量體積(g/ml)比為5：16；

S2、濃縮：取S1中得到的清液A超濾，取超濾液納濾得到濃縮液B，用鹽酸水溶液調(diào)節(jié)濃縮液B的pH＝2.5得到濃縮液C，其中，超濾膜的截留分子量為4000D，納濾膜為聚醚砜膜，納濾膜的截留分子量為300D；

S3、洗脫：將S2中得到的濃縮液C過(guò)D152樹脂柱，用濃度為0.1mol/l的氨水洗脫，收集洗脫液D，用核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)洗脫液D至核酸蛋白檢測(cè)儀讀數(shù)為570時(shí)停止洗脫，用鹽酸水溶液調(diào)節(jié)洗脫液D的pH＝7后，過(guò)717樹脂柱，用濃度為0.3mol/l的氯化鉀水溶液洗脫，收集得到綜合液E，用核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)綜合液E至核酸蛋白檢測(cè)儀讀數(shù)為≤200時(shí)停止洗脫；

S4、分離：將S3中得到的綜合液E納濾得到濃縮液F；用硝酸水溶液調(diào)節(jié)濃縮液F的pH＝1，加丙酮沉淀，離心得到固體G，其中，納濾膜為聚醚砜膜，納濾膜的截留分子量為300D，濃縮液F和丙酮的重量比為1：4；

S5、純化：將S4中得到固體G加水溶解，過(guò)固定相為改性硅膠的制備色譜，脫鹽，分離，收集分離液，濃縮，凍干得到煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，其中，固體G和水的重量體積(g/ml)比為2：5，脫鹽時(shí)用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1wt％甲醇水溶液以30ml/mim的速度洗滌，其中，固體G、甲醇水溶液的重量體積(g/ml)比為1：80，分離時(shí)用30min內(nèi)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)由3wt％勻速增至10wt％的甲醇水溶液梯度洗脫，其中，洗脫速度為30ml/min，2g的固體G所用洗脫時(shí)間為30min。

主要參考資料

[1] 農(nóng)業(yè)大詞典

[2] CN201511022464.3一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的制備方法

[3] CN201710064412.5煙酰胺腺嘌呤二核苷酸在制備預(yù)防或治療腎臟缺血性損傷藥物中的應(yīng)用

[4] CN201710469665.0煙酰胺腺嘌呤二核苷酸在制備治療炎性痛藥物中的應(yīng)用

[5] CN201210252579.1煙酰胺腺嘌呤二核苷酸在制備防治化療藥物鹽酸阿霉素誘導(dǎo)的肝臟損傷藥物中的應(yīng)用