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1492-24-6 / 谷氨酸變位酶與天冬氨酸-β-脫羧酶偶聯(lián)催化L-谷氨酸合成L-2-氨基丁酸

L-2-氨基丁酸（L-ABA）是一種重要的非天然氨基酸，是制備抗癲癇藥物和抗結(jié)核藥物的關(guān)鍵手性前體，一般由α-鹵酸和丁酮酸還原化學(xué)合成L-ABA。由于化學(xué)試劑毒性大，產(chǎn)物分離純化困難，化學(xué)合成L-ABA的方法是環(huán)境不友好的。豐富的L-谷氨酸可以通過直接的γ-脫羧反應(yīng)為L-ABA的生產(chǎn)提供來源。然而，L-谷氨酸的γ-脫羧反應(yīng)尚未見報道。為了達(dá)到這一目標(biāo)，近期，江南大學(xué)周哲敏課題組設(shè)計了一條由兩步組成的生物合成路線。谷氨酸通過谷氨酸變位酶（GM）轉(zhuǎn)化為3-甲基天冬氨酸，然后由L-天冬氨酸-β-脫羧酶（Asd）進行β-脫羧反應(yīng)。該路線僅包括異構(gòu)化和脫羧反應(yīng)，不需要任何其他氨基供體或輔因子再生；此外，β-脫羧反應(yīng)不可逆，不需要控制反應(yīng)平衡；而且L-谷氨酸比L-蘇氨酸經(jīng)濟得多。

谷氨酸變位酶與天冬氨酸-β-脫羧酶偶聯(lián)催化L-谷氨酸合成L-2-氨基丁酸

谷氨酸變位酶與天冬氨酸-β-脫羧酶偶聯(lián)催化L-谷氨酸合成L-2-氨基丁酸

圖片來源：ACS Catal.

首先對純化的GM進行了表征，在37℃時，催化L-glutamate轉(zhuǎn)化為3-甲基天冬氨酸的比活力為7.5u/mg。同時，選擇了一種來源于抗輻射不動桿菌的、對L-天冬氨酸具有高β-脫羧活性的Asd（ArAsd）作為促進3-甲基天冬氨酸轉(zhuǎn)化為L-ABA的第二種酶。然而，由于底物的特異性，沒有檢測到WT-ArAsd對3-甲基天冬氨酸的活性，這也是氨基酸脫羧酶的一個顯著特征。為了提高3-甲基天冬氨酸β-脫羧活性，在酶結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進行了對ArAsd分子改造。底物進入活性位點的通道有兩個重要的氨基酸殘基S486和K18，將K18變成A18后，在結(jié)構(gòu)上通道口變大。

谷氨酸變位酶與天冬氨酸-β-脫羧酶偶聯(lián)催化L-谷氨酸合成L-2-氨基丁酸

圖片來源：ACSCatal.

為了進一步提高ArAsd對3-甲基天冬氨酸的活性，考慮對催化口袋進行進化。Asd屬于I型PLP酶家族，將L-天冬氨酸轉(zhuǎn)化為L-丙氨酸和CO2，PLP共價結(jié)合在催化口袋的Lys315上，ArAsd中對應(yīng)的殘基為Lys314。因此，首先考慮PLP 5A范圍內(nèi)的殘基。為了確定調(diào)控底物特異性的關(guān)鍵殘基，對這些殘基進行了丙氨酸掃描誘變，結(jié)果是雙突變K18A/V287I的酶活最高。

谷氨酸變位酶與天冬氨酸-β-脫羧酶偶聯(lián)催化L-谷氨酸合成L-2-氨基丁酸

圖片來源：ACSCatal.

最終，以谷氨酸為唯一底物，通過GM與Asd的偶聯(lián)反應(yīng)，構(gòu)建了合成L-2-氨基丁酸的級聯(lián)反應(yīng)。根據(jù)GM和K18A/V287I的特性，反應(yīng)在pH 6.6和37℃下進行，培養(yǎng)4h后，L-谷氨酸（4.5mm）轉(zhuǎn)化率為90%，檢測到L-ABA的含量為4.45mM，L-谷氨酸轉(zhuǎn)化為L-ABA的轉(zhuǎn)化率高達(dá)98.9%。

谷氨酸變位酶與天冬氨酸-β-脫羧酶偶聯(lián)催化L-谷氨酸合成L-2-氨基丁酸

圖片來源：ACSCatal.

參考文獻：Enzymatic Biosynthesis of L?2-Aminobutyric Acid by Glutamate Mutase Coupled with L?Aspartate-β-decarboxylase Using L?Glutamate as the Sole Substrate

ACS Catal.

DOI：10.1021/acscatal.0c04141