27565-41-9 / DTT的應(yīng)用

背景及概述^[1][2]

二硫蘇糖醇(DL-Dithiothreitol，簡稱為DTT)是一種小分子有機(jī)還原劑，化學(xué)式為C4H10O2S2，主要應(yīng)用于生物技術(shù)領(lǐng)域，作為蛋白質(zhì)裂解試劑。DTT是一種很強(qiáng)的還原劑，其還原性很大程度上是由于其氧化狀態(tài)六元環(huán)（含二硫鍵）的構(gòu)象穩(wěn)定性。DTT的用途之一是作為巰基化DNA的還原劑和去保護(hù)劑。巰基化DNA末端硫原子在溶液中趨向于形成二聚體，特別是在存在氧氣的情況下。

這種二聚化大大降低了一些偶聯(lián)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)（如DNA在生物感應(yīng)器中的固定）的效率；而在DNA溶液中加入DTT，反應(yīng)一段時(shí)間后除去，就可以降低DNA的二聚化。DTT也常常被用于蛋白質(zhì)中二硫鍵的還原，可用于阻止蛋白質(zhì)中的半胱氨酸之間所形成的蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間二硫鍵。其中，第一步反應(yīng)所形成的中間態(tài)很不穩(wěn)定，因?yàn)镈TT上的第二個(gè)巰基趨向于與被氧化的硫原子連接，使中間態(tài)很快被轉(zhuǎn)化為DTT的環(huán)狀氧化結(jié)構(gòu)，從而完成對二硫鍵的還原。

DTT的還原力受pH值的影響，只在pH值大于7的情況下能夠發(fā)揮還原作用。這是因?yàn)橹挥忻撊ベ|(zhì)子的硫醇鹽負(fù)離子才具有反應(yīng)活性，硫醇則沒有；而巰基的pKa一般為8.3。然而該物質(zhì)長期依賴進(jìn)口，而且價(jià)高昂貴。因此，低成本合成該物質(zhì)具有一定的市場前景。

目前應(yīng)用最廣泛的DTT合成方法是以蘇蘚糖醇為原料，先用高錳酸鉀氧化，再在硫代乙酸作用下得到硫代中間體，最后水解該硫代中間體得到DTT。該方法的缺陷在于：在生成硫代中間體的同時(shí)，會生成一個(gè)DTT的同分異構(gòu)體雜質(zhì)，該雜質(zhì)的理化性質(zhì)和DTT極為相近，從而導(dǎo)致DTT分離提純困難，產(chǎn)率低，生產(chǎn)成本昂貴，僅適用于實(shí)驗(yàn)室合成，不適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

DTT

應(yīng)用^[3]

制備熒光羊毛織物：

（1）溶解液的制備：將30gDTT和2g十二烷基硫酸鈉加入到蒸餾水中，形成100g混合溶液，調(diào)節(jié)pH至8-9，然后加入0.5g長余輝紅色發(fā)光熒光粉La2O2S:Eu3+納米粒子，超聲振蕩下得到分散有長余輝紅色發(fā)光熒光粉La2O2S:Eu3+納米粒子的溶解液；

（2）將羊毛織物在步驟（1）所得的溶解液中多次浸軋，軋余率為110%；

（3）將浸軋后的羊毛織物在130℃熱風(fēng)下加熱15min；

（4）將加熱后的羊毛織物浸漬于乙醇溶液中凝固10min，然后水洗、烘干。

制備^[2]

步驟一：

在500ml圓底燒瓶中依次加入17.9克酒石酸二甲脂，81ml2，2?二甲氧基丙烷，8.6克對甲苯磺酸，240ml二氯甲烷，攪拌反應(yīng)。反應(yīng)完畢后，減壓除去溶劑，加入40ml水，用乙酸乙酯萃取，合并有機(jī)相，用無水硫酸鎂干燥，減壓除去溶劑，得到產(chǎn)品2,3?O?異亞丙基酒石酸二甲酯化合物21.1克。收率約99%。

步驟二：

在250ml圓底燒瓶中加入21.1克2,3?O?異亞丙基酒石酸二甲酯化合物，加入100mlCH3OH，緩慢加入17克NaBH4，攪拌反應(yīng)24小時(shí)。用乙酸乙酯萃取，合并有機(jī)相，用無水MgSO4干燥，除去溶劑得到2,3?O?異亞丙基蘇醇產(chǎn)品15.6克。收率約98%。

步驟三：

在250ml圓底燒瓶中加入7.8克2,3?O?異亞丙基蘇醇化合物和60mlTHF，緩慢的加入2克NaH，攪拌反應(yīng)30min后，加入20克p?TsCl，升溫至50℃，反應(yīng)24小時(shí)，用TLC檢測反應(yīng)，待反應(yīng)完全后，加入飽和NaHCO3溶液，用乙酸乙酯萃取，合并有機(jī)相，用H2O洗滌，用無水MgSO4干燥，除去溶劑，得到產(chǎn)品2,3?O?異亞丙基蘇醇對甲基苯磺酸酯23克。收率約92%。

步驟四：

在100ml圓底燒瓶中加入23克2,3?O?異亞丙基蘇醇對甲基苯磺酸酯，15克硫代乙酸鉀、25ml乙醇，回流反應(yīng)12小時(shí)，冷卻至室溫，加入50ml乙醚，過濾，濾液蒸干后加入100mlH2O，用乙醚萃取，用無水MgSO4干燥，除去溶劑，得到2,3?O?異亞丙基二硫蘇糖醇二乙酸酯化合物14克，收率約92%。

步驟五：

將14克2,3?O?異亞丙基二硫蘇糖醇二乙酸加入質(zhì)量百分比濃度為25％的氫氧化鈉溶液，攪拌反應(yīng)5小時(shí)，冷卻到室溫，用質(zhì)量百分濃度為2％的鹽酸溶液調(diào)節(jié)PH至7?8之間，用乙酸乙酯萃取，合并有機(jī)層，在常壓下蒸掉溶劑，殘余濃縮液在真空度為15毫米汞柱，溫度為200℃左右條件下進(jìn)行減壓蒸餾，收集130?140℃之間的餾分，冷卻至室溫，得到白色固體DTT8.2克。收率約90%。

檢測方法

S1、將玻碳電極進(jìn)行打磨清洗后作為工作電極組成一個(gè)三電極體系，并浸入氨基 化石墨烯量子點(diǎn)溶液，通過循環(huán)伏安法掃描，在玻碳電極表面電沉積氨基化石墨烯量子點(diǎn)， 所采用的打磨清洗方法為常規(guī)物理處理方法，故不再贅述，所組成的三電極體系中的輔助 電極是鉑絲電極，參比電極是甘汞電極，氨基化石墨烯量子點(diǎn)溶液的濃度為2mg/mL，采用循 環(huán)伏安法對玻碳電極進(jìn)行掃描的參數(shù)設(shè)置為：初始電位0V、最高電位1V、最低點(diǎn)位0V、最終 電位0V、掃描速率0.1V/s、掃描次數(shù)100次、靈敏度10-4A/V、等待時(shí)間為2s，掃描完成后，將修 飾好的玻碳電極置入紅外干燥箱中烘干20min，然后取出備用；

S2、配置含有1.0×10-4mol/L鄰苯二酚的不同濃度DTT的PBS緩沖溶液，選 用的PBS緩沖溶液的pH值均為7.4，濃度均為0.1mol/L，DTT的濃度分別為0mol/L、 5.0×10-6mol/L、1×10-5mol/L、1.5×10-5mol/L、2×10-5mol/L、2.5×10-5mol/L、5×10- 5mol/L；

S3、將經(jīng)過步驟一處理的玻碳電極作為工作電極組成和步驟一種相同的三電極體 系，并浸入步驟二中配置的不同濃度DTT的PBS緩沖溶液中，通過循環(huán)伏安法測出每 種濃度DTT的PBS緩沖溶液對應(yīng)的差分脈沖伏安曲線，采用循環(huán)伏安法進(jìn)行掃描的 參數(shù)設(shè)置為：初始電位-0.4V、最高電位1V、最低點(diǎn)位-0.4V、最終電位-0.4V、掃描速率 0.05V/s、掃描次數(shù)2次、靈敏度10-4A/V、等待時(shí)間為2s，結(jié)果如圖1所示，圖上曲線從上至下 依次代表濃度分別為0mol/L、5.0×10-6mol/L、1×10-5mol/L、1.5×10-5mol/L、2×10-5mol/ L、2.5×10-5mol/L、5×10-5mol/L的DTT的PBS緩沖溶液在-0.4V～1V的掃描范圍內(nèi)， 電流值的連續(xù)變化過程；

S4、從圖1中可以觀察到反應(yīng)的電流峰值與隨DTT的濃度增大有明顯增加， 故取每個(gè)濃度的氧化峰電流值，建立DTT濃度與其氧化峰電流值之間的點(diǎn)陣圖譜， 如圖2所示，并擬合出線性關(guān)系表達(dá)式：Y＝-2.506-0.0299X，R2＝0.9994；

S5、取某未知濃度的DTT溶液，加入含1.0×10-4mol/L鄰苯二酚的pH值為 7.4的0.1mol/L的PBS緩沖溶液中，然后按步驟三中的方法對含鄰苯二酚的未知DTT濃度的PBS緩沖溶液進(jìn)行掃描，讀出氧化峰電流值，再帶入步驟四中的關(guān)系式，計(jì)算后即可 推導(dǎo)出未知濃度的DTT溶液中DTT的濃度。

主要參考資料

[1]姜闖道, 高輝遠(yuǎn), 鄒琦, & 蔣高明. (2003). 二硫蘇糖醇處理導(dǎo)致大豆葉片兩光系統(tǒng)間激發(fā)能分配失衡. 植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報(bào), 29(6), 561-568.

[2] 董改寧, 王新軍, 唐量, & 熊正英. (2003). 二硫蘇糖醇對小鼠運(yùn)動耐力、肝組織自由基代謝、肝糖原含量及血清gpt活性影響研究. 陜西師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 31(2), 63-66.

[3] 陳新斌, 孫錦, 郭世榮, 陸曉民, 何立中, & 嚴(yán)蓓. (2012). 二硫蘇糖醇對海水脅迫下菠菜活性氧代謝及葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊? 園藝學(xué)報(bào), 39(12), 2457-2467.