491-67-8 / 黃芩的基因組測(cè)序揭示黃芩素的生物合成的進(jìn)化

摘要：黃芩是一種非常重要的中藥材，主要是利用曬干的根部，在中國(guó)被稱為“黃芩”。它主要用來(lái)治療肝臟和肺上的問(wèn)題，可以作為一種癌癥治療的補(bǔ)充藥物。我們報(bào)道了一種高質(zhì)量的黃芩參考基因組，其中408.14 Mb基因組的93%被用來(lái)組裝成9個(gè)假-染色體，N50達(dá)到了33.2Mb。與其他唇形科相近的物種芝麻和一串紅進(jìn)行基因組比較，揭示了黃芩中與生物活性物質(zhì)4’-脫氧黃酮的生物合成的代謝途徑相關(guān)的基因。我們發(fā)現(xiàn)了一種特殊的肉桂酸輔酶A連接酶很可能最近的突變后獲得了新的功能。在4’-脫氧黃酮的合成途徑中，有四個(gè)基因編碼的酶在黃芩基因組中是串聯(lián)重復(fù)的。更深入的分析在黃芩屬植物中揭示了基因的重復(fù)性，片段的重復(fù)，基因的擴(kuò)增和點(diǎn)突變偶聯(lián)基因的新功能和亞功能化涉及到了4’-脫氧黃酮的生物合成。在薄荷家族中，唇形科，我們的研究不僅為特定的黃酮生物合成途徑的進(jìn)化提供了重要的見(jiàn)解，而且為利用微生物的代謝工程或植物的分子育種來(lái)提高活性物質(zhì)的生產(chǎn)提供了一種重要的工具。黃芩的參考基因組是非常有用的，可改進(jìn)薄荷家族其他成員的基因組組裝，為藥用植物中生物活性化合物的合成途徑的解碼提供了重要的基礎(chǔ)。

雜志名：Molecular Plant（一區(qū)13.2）（Volume 12, Issue 7, 1 July 2019, Pages 935-950）

英文題目：The ReferenceGenome Sequence ofScutellaria baicalensisProvides Insights into theEvolution of Wogonin Biosynthesis

作者：QingZhao1…Yonghong Hu1, Xiao-Ya Chen1,2 and Cathie Martin1,7

單位：中國(guó)科學(xué)院上海辰山植物科學(xué)研究中心上海市植物功能基因組學(xué)與資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海辰山植物園，上海

黃芩作為一種重要的中藥，在中國(guó)已經(jīng)有2000多年的歷史。黃芩中的黃酮類物質(zhì)具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗癌、保肝和保護(hù)神經(jīng)的作用。因此理解黃酮的合成途徑變得尤為重要，了解其分子合成和調(diào)控機(jī)制為我們更好的利用黃酮提供基礎(chǔ)。黃芩素是黃芩中含量最高的黃酮類化合物之一。

黃芩中黃酮的生物合成有兩條途徑，一條路徑是，phenylalanine ammonia lyase (SbPAL), cinnamate4-hydroxylase (SbC4H), 4-coumarate coenzyme A (CoA) ligase (SbCLL1), chalcone synthase(SbCHS-1), chalcone isomerase (SbCHI), and flavone synthase II (SbFNSII1),導(dǎo)致4’-脫氧黃酮的合成。在根部，出現(xiàn)了另一種黃酮合成路徑（RSF），cinnamate-CoA ligase (SbCLL-7)。（圖1）

圖1黃芩中黃酮的兩條生物合成途徑

目前，我們已經(jīng)闡明了黃芩素和去甲漢黃芩素的生物合成途徑，但最后一步去甲漢黃芩素到漢黃芩素的生物合成過(guò)程，是由8-O-甲基轉(zhuǎn)移酶催化，還有待說(shuō)明。因此全基因組測(cè)序是一種切實(shí)可行的策略，對(duì)天然化合物的代謝途徑的識(shí)別非常有幫助。這里，我們采用了二代高通量Illumina和三代PacBio聯(lián)合測(cè)序技術(shù)，報(bào)道了黃芩的參考基因組。總基因組大小為408.14 Mb,其中386.63 Mb組裝到了染色體水平，達(dá)到了9個(gè)假染色體。將已公布的丹參、芨芨草和獐牙菜的基因組進(jìn)行比較分析，RSFs生物合成的進(jìn)化路徑似乎是通過(guò)編碼輔酶A連接酶的基因的特異性聚集而出現(xiàn)的(圖1;SbCLL-7)以及多個(gè)串聯(lián)基因復(fù)制(圖1:SbCHS-2, SBFNSII-2, SBF8h)。通過(guò)對(duì)基因組和轉(zhuǎn)錄組序列的篩選，確定了負(fù)責(zé)漢黃芩素合成的O-甲基轉(zhuǎn)移酶(OMTs)，并通過(guò)酵母體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和黃芩毛狀根的RNAi實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這一結(jié)果。

為了便于對(duì)黃芩基因組進(jìn)行注釋，獲得黃芩基因的表達(dá)譜。我們對(duì)黃芩不同品系的花、花蕾、葉、莖、根和茉莉酸(JA)處理過(guò)的根的RNA樣本進(jìn)行了測(cè)序。每個(gè)組織的RNA樣本以三份形式提取，并使用HiSeq 2000平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序?？偣驳玫搅?8930個(gè)基因。圖2顯示了基因、重復(fù)、非編碼RNA密度和所有檢測(cè)到的片段重復(fù)的概述。

圖2黃芩基因組組裝的圖譜概述

比較基因組分析，我們組裝了黃芩基因組，并與其他10個(gè)基因組進(jìn)行比較分析。我們識(shí)別了28133個(gè)基因家族，全部11個(gè)物種有共同6811個(gè)。我們比較了四個(gè)相近物種的基因組。全部11個(gè)基因組共有的299個(gè)單拷貝基因家族，根據(jù)其建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。（圖3）

圖3比較基因組分析

尋找RSF通路演化的線索，我們對(duì)黃芩、丹參、芨芨草和苘麻四種相近的植物進(jìn)行了黃酮生物合成途徑中關(guān)鍵酶的解析篩選。用三種4CL底物:肉桂酸，4-香豆酸和咖啡酸進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)肉桂酸是SbCLL-7的底物，SbCLL-7的活性位點(diǎn)狹窄，由疏水殘基組成，有利于疏水底物，如肉桂酰腺苷酸，底物通過(guò)與Thr343和Asp424的氫鍵配位，而導(dǎo)致SbCLL-7能夠使用肉桂酸作為底物的變化一定與CLL-7基因的點(diǎn)突變有關(guān)。（圖4）

圖4黃芩中特殊ScCLL7的分析

黃芩編碼兩種CHS亞型，即SbCHS-1和SbCHS-2。SbCHS-1基因在地上部分高度表達(dá)，特別是在花中，并編碼一種參與經(jīng)典的黃酮和花青素生物合成的酶。黃芩黃酮合成酶II(FNSII)有兩種亞型:FNSII-1在植物地上部分將水仙素轉(zhuǎn)化為芹菜素，而FNSII-2在根中特異合成chrysin。黃芩基因組中有兩個(gè)編碼FNSII-1蛋白的基因，編號(hào)為Sb06g05860 (FNSII-1.1)和Sb03g20730 (FNSII-1.2)分別在假染色體6號(hào)和3號(hào)。SbCYP82D2是一種黃酮8-羥化酶，在根中只接受白楊素生成去甲漢黃芩素，分布在假染色體5號(hào)。

圖5黃芩CHS基因的進(jìn)化過(guò)程

圖6 SbFNSII和SbCYP82D基因的串聯(lián)復(fù)制

我們?cè)诮湍钢斜磉_(dá)了五種PFOMT ORFs，并用去甲漢黃芩素作為底物去喂養(yǎng)細(xì)胞。所有五種酵母菌株都可以將去甲漢黃芩素轉(zhuǎn)化為漢黃芩素。后進(jìn)行RNAi干擾確定了OMT的基因功能。

圖7漢黃芩素（Wogonin）生物合成的候選PFOMT基因的篩選

討論：特定的代謝物對(duì)植物適應(yīng)不同環(huán)境非常重要，這些化合物通常是特異性的、嚴(yán)格調(diào)控的、高度可進(jìn)化的。特定代謝途徑的進(jìn)化是由基因復(fù)制和隨后的亞/新功能驅(qū)動(dòng)的。黃芩屬植物的黃芩素的RSF合成途徑具有特異性?；谖覀兊谋容^基因組分析，我們現(xiàn)在可以描述這種特定的代謝途徑可能是如何進(jìn)化的。之后，對(duì)RSF途徑上的每個(gè)酶進(jìn)行系統(tǒng)分析，我們沒(méi)有發(fā)現(xiàn)什么有用的基因聚類，但是發(fā)現(xiàn)了編碼關(guān)鍵標(biāo)記酶SbCLL-7的基因和編碼下一步CHS-2酶的基因都位于假染色體9上。也許這是基因聚類促進(jìn)多態(tài)群體中4’-脫氧黃酮生物合成的最早步驟共同進(jìn)化的證據(jù)，盡管這一連鎖并不緊密(兩個(gè)位點(diǎn)大約有12000個(gè)基因分開(kāi))，但在目前的標(biāo)準(zhǔn)下還不能作為基因聚類的證據(jù)。

黃芩屬的參考基因組的分析比較與高質(zhì)量的兩個(gè)密切相關(guān)的物種的基因組序列，已經(jīng)允許我們提出這個(gè)黃酮的新代謝途徑是如何進(jìn)化和顯示,一系列不同的進(jìn)化機(jī)制導(dǎo)致了一個(gè)屬中出現(xiàn)了特殊的代謝途徑。與薄荷家族其他成員的高質(zhì)量基因組進(jìn)行相互比較，同樣可以闡明萜類化合物的特殊生物合成途徑的進(jìn)化，如二萜丹參酮、酚酸和黃酮類化合物在這個(gè)代謝多樣化的植物家族中的進(jìn)化。