56-87-1/賴氨酸檢測(cè)方法匯總

賴氨酸是世界上僅次于谷氨酸的第二大氨基酸品種，目前主要應(yīng)用于飼料添加劑、食品添加劑和醫(yī)藥中間體。賴氨酸是人體必需而又無(wú)法自身合成的第一限制性氨基酸，有 “第一缺乏氨基酸 ” 之稱 , 是海洋降壓藥 “藻白金 ” 的主要合成原料。賴氨酸在維持體內(nèi)酸堿平衡，合成核蛋白、血紅蛋白 、促進(jìn)大腦神經(jīng)細(xì)胞的再生、參與脂肪代謝、提高機(jī)體抵抗力、保持人體氮平衡等生理活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用。 隨著科技的發(fā)展，賴氨酸品種已經(jīng)發(fā)展出賴氨酸鹽酸鹽、蛋白賴氨酸和液體賴氨酸等 。

目前常用的賴氨酸檢測(cè)方法主要有甲醛滴定法 、高效液相色譜（HPLC）、化學(xué)法（茚三酮）法和西爾曼科技酶電極法。

一、滴定法

1.原理：供試品加醋酸汞試液使溶解后，再加入冰醋酸，賴氨酸上的兩個(gè)氨基與高氯酸反應(yīng)，按照電位滴定法，用高氯酸滴定液（0.1mol/L)滴定，記錄高氯酸滴定液的使用量，計(jì)算，即得。

2.步驟：

精密稱取供試品80mg，加醋酸汞試液5mL使溶解后，加冰醋酸25mL，照電位滴定法，用高氯酸滴定液（0.1mol/L)滴定，并將滴定的結(jié)果用空白試驗(yàn)校正，記錄消耗高氯酸滴定液的體積數(shù)（mL)，每1mL高氯酸滴定液（0.1mol/L)相當(dāng)于9.133mg的鹽酸賴氨酸（C6H14N2O2·HCl )，即得。

注1：“精密稱取”系指稱取重量應(yīng)準(zhǔn)確至所稱取重量的千分之一,“精密量取”系指量取體積的準(zhǔn)確度應(yīng)符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)該體積移液管的精度要求。

二、HPLC

1.原理：采用鄰苯二醛(OPA)衍生化，采用高效液相色譜-紫外檢測(cè)法對(duì)衍生物進(jìn)行檢測(cè)

2.步驟：

（1）樣品的配制 :量取賴氨酸鹽酸鹽注射液適量(應(yīng)使所得測(cè)定液的濃度在 400 ～ 500 μg/mL 范圍內(nèi)),用與上述相同的 70 %乙醇稀釋至刻度,混勻；

（2）樣品的衍生：量取 0.15 %OPA 溶液 2 mL 置于具塞玻璃反應(yīng)管內(nèi) ,加 0.5 mL 按上述方法配制的測(cè)定液, 密塞后混勻管內(nèi)液體 , 將反應(yīng)管置于沸水浴中加熱1 min ,取出后立即冷卻至室溫 ,進(jìn)樣 10 μL 至液相色譜儀中，在326 nm下檢測(cè)。

三、茚三酮法

1.原理：賴氨酸和茚三酮在弱酸性條件下共熱可以生成紫紅色物質(zhì) , 且其顏色隨賴氨酸濃度的變化而改變。

2.步驟

（1.）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 配制不同濃度的賴氨酸溶液 , 加入 1.0mLpH為 6.0 的醋酸鹽緩沖溶液和 1.0mL茚三酮試劑 ,水浴加熱 15min, 冷卻 10min后定容, 在 570nm處測(cè)定其吸光度 , 濃度和吸光度關(guān)系曲線。

（2）準(zhǔn)確量取 2.0mL賴氨酸溶液, 加入一定量的緩沖溶液和茚三酮試劑, 水浴加熱, 冷卻后定容至 25mL, 在 570nm處測(cè)定其吸光度。

四、酶電極法

1.原理：主要是通過(guò)賴氨酸在特異的氧化酶催化下發(fā)生氧化還原反應(yīng)，其電子產(chǎn)物在生物傳感器電極表面形成電流從而進(jìn)行測(cè)定。

2. 步驟：（1）樣品的前處理：根據(jù)檢測(cè)目的選擇是否水解樣品，將試樣溶于水，做一定稀釋最終樣品賴氨酸濃度控制在0—200mg/ml

（2）樣品的檢測(cè)：將樣品放入樣品盤，選擇樣品編號(hào)，設(shè)置檢測(cè)次數(shù)，點(diǎn)擊測(cè)試，20秒檢測(cè)完成后自動(dòng)打印檢測(cè)結(jié)果。

五、總結(jié)

高氯酸定法測(cè)定根據(jù)滴定終點(diǎn)時(shí)高氯酸的消耗量來(lái)計(jì)算賴氨酸濃度誤差較大。茚三酮方法基本原理為：氨基酸與水合茚三酮共同加熱后可發(fā)生氧化脫氨反應(yīng)，生成 NH3 與酮酸 ；加熱過(guò)程中酮酸裂解，放出 CO2，自身變?yōu)樯僖粋€(gè)碳的醛，水合茚三酮變?yōu)檫€原型茚三酮。NH3 與水合茚三酮及還原茚三酮脫水縮合，生成藍(lán)紫色化合物。傳統(tǒng)的茚三酮檢測(cè)方法無(wú)法排除雜質(zhì)氨基酸的干擾且反應(yīng)過(guò)程中易受 pH 和溫度變化的影響，造成測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確性降低。HPLC 方法采用 2，4-二硝基氟苯（DNFB）、1-氟-2，4-二硝基苯基 -5-L-丙氨酰胺（FDAA）等衍生化試劑，雖然能夠精確區(qū)分和測(cè)定D-/L-型賴基酸的含量，但對(duì)儀器精密度和操作人員要求極高，并且易受樣品中雜質(zhì)成分的干擾，完成一個(gè)全分析費(fèi)時(shí) 25min，賴氨酸衍生物的流出時(shí)間為 14 min，費(fèi)時(shí)費(fèi)力費(fèi)錢！酶電極法利用酶的催化反應(yīng)，具有反應(yīng)快速、專一性強(qiáng)等特點(diǎn)，利用酶的固定化可以重復(fù)利用酶耗材，達(dá)到低成本、快速檢測(cè)的目的。