9003-99-0 / 過氧化物酶的制備方法

背景及概述^{[1][2] [3]}

催化過氧化氫分解而使其他氫供體氧化并生成水的一類酶。有不同的同工酶，有的底物專一性較強(qiáng)，有的無專一性。輔助因子也可不同，如谷胱甘肽過氧化物酶含硒；NAD+過氧化物酶含F(xiàn)AD；細(xì)胞色素c過氧化物酶含血紅素等。

過氧化物酶廣泛分布于各種植物組織中，在動(dòng)物組織中較少見。動(dòng)物的肝、腎中只有微弱的活性，在牛乳中已分離出過氧化物酶，在白細(xì)胞中含有髓性過氧化物酶，這就是膿具有過氧化物酶活性的原因。紅細(xì)胞也含過氧化物酶，極少量的血，在過氧化物存在時(shí)，就能使聯(lián)苯胺或愈創(chuàng)樹脂氧化成有色物質(zhì)，這就是檢查糞、尿“隱血”的原理。

制備方法^[4-5]

CN201510367541.2提供一種可以用于工業(yè)化生產(chǎn)高回收率和純化倍數(shù)可用于食品工業(yè)的乳過氧化物酶提取方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：以牛乳清為原料，以硫酸銨鹽析法為提取手段，確定硫酸銨鹽析法中最佳鹽析條件下飽和度、鹽析時(shí)間、最佳轉(zhuǎn)速、體系pH的工藝條件，并比較了硫酸 銨鹽分級(jí)沉淀與直接一次用65％硫酸銨飽和度對(duì)LP酶活回收率和純化倍數(shù)的影 響。采用超濾技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步純化，最后透析脫鹽和冷凍干燥制得成品，即原料乳清→硫酸銨鹽析法分級(jí)沉淀提取乳過氧化酶→沉淀溶解→溶液使用超濾分 離→收集截留溶液→透析脫鹽→冷凍干燥→乳過氧化物酶粗產(chǎn)品。具體的，本發(fā)明的一種采用超濾法輔助硫酸銨鹽析提取乳過氧化物酶的方 法，包含以下步驟：

(1)硫酸銨鹽析法分級(jí)提取乳過氧化物酶：

除去新鮮的牛乳中的脂肪和酪蛋白后得到乳清，在室溫條件下，向乳清中 添加25-85％飽和度的硫酸銨，離心，去除沉淀，置于攪拌器上不斷攪拌使硫酸 銨充分溶解，調(diào)節(jié)體系pH到5.5-8.5，放置2-10h使乳過氧化物酶完全沉淀， 4℃5000-10000r/min離心20min到沉淀即為乳過氧化物酶制品；

(2)超濾：

將步驟(1)中得到的沉淀使用適量去離子水復(fù)溶用超濾膜進(jìn)行超濾分離， 以除去雜蛋白，收集截留溶液；

(3)脫鹽處理：

將步驟(2)收集的截留溶液裝入透析袋內(nèi)進(jìn)行脫鹽；

(4)干燥：

將步驟(3)脫鹽溶液冷凍干燥即制得乳過氧化物酶粗制品。

采用本發(fā)明提取的乳過氧化物酶粗產(chǎn)品為淡黃色粉狀物，乳過氧化物酶的 酶活回收率和純化倍數(shù)分別達(dá)到79.25-85.21％和4.08-4.58倍。通過上述提取工藝可以直接獲得回收率較高的乳過氧化物酶，可以直接制 得天然的抗菌介質(zhì)乳過氧化物酶制品，也可以將其制品作為天然防腐劑直接加 入到食品中。

通過上述提取方法可以直接獲得回收率較高的乳過氧化物酶，可以直接制 得天然的抗菌介質(zhì)乳過氧化物酶制品，也可以將其制品作為天然防腐劑直接加 入到食品和牙膏等日用品中。

二、辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase, HRP, E.C.1.11.1.7）是由酶蛋白和鐵卟啉結(jié)合而成的一種糖蛋白，該酶由多個(gè)同功酶組成，分子量為40kDa，等電點(diǎn)為pH3.0?9.0。HRP的輔基和酶蛋白最大吸收光譜分別在403nm和275nm，所以人們通常采用RZ值（即OD403nm /OD275nm的比值）來表示該酶的純度， RZ值越大，純度越高。

HRP是最重要的醫(yī)療診斷用酶之一（J. Chromat. B 2004,803:237?241），該酶不但用于多個(gè)生化檢測項(xiàng)目，還廣泛運(yùn)用于免疫類試劑盒。除此之外，HRP還可用于工業(yè)廢水的脫色（Chem. Technol. Biotechnol. 2009,84:126–132），過氧化物的去除以及含酚污水的處理（Biotechnol. Bioprocess Eng. 2006,11:462–465）等。

在自然界中，辣根是HRP含量最高的植物，因此也成為生產(chǎn)HRP最具吸引力的原料。目前，從辣根中分離提取HRP的主要方法有：雙水相萃取技術(shù)（Appl. Biochem. Biotechnol. 1995, 53:147?154）、反膠束萃取技術(shù)（Enzyme Microb. Technol. 1996,18:332?339）、電泳技術(shù)（J. Biol. Chem. 1966,241:2166?2172）及層析技術(shù)（J. Membr. Sci. 2003,211:101?111）等。然而這些技術(shù)均存在一定的缺陷，其中，雙水相萃取技術(shù)和反膠束萃取技術(shù)獲得的產(chǎn)品純度較低，且容易引起HRP的失活和變性；電泳技術(shù)和層析技術(shù)的成本昂貴，且難于工業(yè)放大。

CN201210112799.4提供一種操作簡單、易于放大、產(chǎn)品純度高的辣根過氧化物酶的超濾提取方法。本發(fā)明的技術(shù)方主要包括以下步驟：

（1）將辣根破碎、浸提、離心得到辣根過氧化物酶粗提液；

（2）將辣根過氧化物酶粗提液用截留分子量為70kDa?100kDa的超濾膜進(jìn)行超濾分離，得到辣根過氧化物酶超濾液；

（3）將辣根過氧化物酶超濾液用截留分子量為1?30kDa的超濾膜進(jìn)行超濾濃縮，得到辣根過氧化物酶濃縮液；

（4）將辣根過氧化物酶濃縮液脫水得到辣根過氧化物酶。

檢測方法^[6]

一種豬肉中過氧化物酶的快速定量檢測方法，其特征在于，所述的檢測方法包括以下步驟：

(1)配制一系列以辣根過氧化物酶為標(biāo)準(zhǔn)酶的標(biāo)準(zhǔn)酶溶液；

(2)以過氧化脲為反應(yīng)底物，以3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺為顯色劑，以磷酸 二氫鈉緩沖液為緩沖液，分別測試步驟(1)中所配制的標(biāo)準(zhǔn)酶溶液，測試的反 應(yīng)溫度為20-30℃，反應(yīng)pH值為4.0-5.0，反應(yīng)時(shí)間為30-90s，反應(yīng)結(jié)束后加入 稀硫酸溶液，終止反應(yīng)，獲得反應(yīng)產(chǎn)物溶液；

(3)將各反應(yīng)產(chǎn)物溶液置于紫外分光光度計(jì)中，在450nm的吸收波長下分 別測定其OD值，獲得辣根過氧化物酶濃度-OD值的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

(4)測試待測豬肉中過氧化物酶反應(yīng)后其反應(yīng)產(chǎn)物溶液的OD值，根據(jù)標(biāo) 準(zhǔn)曲線計(jì)算出豬肉中過氧化物酶的濃度。圖1為辣根過氧化物酶濃度-OD值的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

主要參考資料

[1] 農(nóng)業(yè)大詞典

[2] 中國醫(yī)學(xué)百科全書·十七 生物化學(xué)

[3] 中國茶葉大辭典

[4] CN201510367541.2 一種采用超濾法輔助硫酸銨鹽析提取乳過氧化物酶的方法

[5] CN201210112799.4 超濾提取辣根過氧化物酶的方法

[6] CN201511001061.0 一種豬肉中過氧化物酶的快速定量檢測方法